Diseño y Evaluación de un sistema colorimétrico para análisis clínicos en celdas ELISA.

Abstract

La mayoría de los análisis clínicos que se realizan en la actualidad, se basan en ensayos colorimétricos, donde las propiedades ópticas de la sustancia de interés, permiten su detección y posterior cuantificación, mediante la aplicación de la Ley de Beer. Para detectar la radiación absorbida por el analito, suelen utilizarse espectrómetros sencillos, tales como fotocolorímetros y/o equipos dispersivos altamente sofisticados, tales como espectrofotómetros o sistemas multicanal. Normalmente en este tipo de análisis, se requiere procesar simultáneamente una elevada cantidad de muestras, por tal razón se han desarrollado los denominados “lectores de placas de ELISA”, que permiten medir en un solo paso hasta 96 muestras. Estos lectores presentan una alta sensibilidad y emplean sistemas mecánicos para desplazar la muestra y leer los 96 pozos uno a uno o en el mejor de los casos en grupos de 8. En el presente trabajo, se construyó un analizador colorimétrico, para ser utilizado en la realización de algunos ensayos del tipo inmuno-enzimáticos, ELISA. Este analizador tiene una fuente de radiación que consiste de un arreglo plano de diodos de emisión de luz, leds, color blanco. El receptáculo de la muestra es una placa ELISA de 96 micro-pozos y el sistema de detección es una cámara Web. El dispositivo se utilizó para determinar simultáneamente la absorción de luz sobre soluciones coloreadas, contenidas en los micro-pozos de la placa ELISA. Para el tratamiento de los datos, se diseñó un software que permite capturar las imágenes de la placa, digitalizarla y separarla en sus componentes RGB (rojo, verde y azul) e intensidad. De esta manera, se transforman las imágenes en superficies de respuesta de intensidades para cada color al que responde los filtros de la cámara, permitiendo de esta forma al compararlo con una referencia, calcular la absorbancia de un punto en particular de la imagen y así mediante una curva de calibración obtener la concentración de una determinada sustancia en ese punto. El sistema colorimétrico se comparó con respecto a un espectrofotómetro convencional, se obtuvo una menor sensibilidad del primero respecto al segundo, no obstante los demás parámetros de calibración, fueron similares en magnitud con lo cual se concluyó que ambos sistemas presentaban una eficiencia analítica similar . Finalmente, se evaluó la aplicación del analizador, en la determinación de las concentraciones de glucosa y de proteínas en plasma de ratas. Se obtuvieron en los animales estudiados, niveles de glucosa en el intervalo de 750 a 3000 mg.L-1, mientras que para los proteínas, los niveles fueron de 2.5 a 10 g/100 mL. Ambos resultados están dentro de los niveles normales, para la glucosa 600 – 1000 mg.L-1 y para las proteínas entre 6,4 – 8,3 g/100 mL-1, con estos valores los animales presentan ausencia en las patologías esperadas, esto es diabetes y enfermedades renales, respectivamente. Los resultados obtenidos fueron comparados con aquellos suministrados por un espectrómetro convencional, se encontró que los resultados no presentan diferencias significativas a un nivel de confianza del 95%, lo que indica una alta exactitud del sistema. Estos resultados permitieron validar la eficiencia del analizador diseñado en la realización de estos análisis clínicos en muestras reales. Por otro lado, se obtiene una precisión del 7-8% para el sistema colorimétrico y de 4- 6% en el espectrómetro al determinar proteínas; mientras que para la glucosa se obtuvo una precisión de 2-9% en el sistema propuesto.